Rozpoznawanie laboratoryjne zakażeń układu oddechowego z uwzględnieniem krztuśca i mykoplazmy

-zaczynając te rozważania diagnostyczne,jeżeli chodzi o zakażenia drógoddechowych, chciałabym rozpocząć od rzeczy podstawowej,czyli od dróg zakażeńpatogenami wywołującymi te infekcje.Jest to inhalacja.Może to być bezpośrednia inokulacjaz przedmiotów, które są zanieczyszczone drobnoustrojami.Może być to aspiracja, kiedyzapalenie płuc jest wywołane drobnoustrojami znajdującymisię w jamie ustnej, którekolonizują drogi oddechowe, może być drogakrwiopochodna lub może do tegozakażenia dojść do przerwania poprzez przerwanieciągłości tkanek.Oczywiście te wszystkie drogi zakażeniamówią nam również o próbkach, któremożemy pobrać do tej diagnostykii po części o metodach badawczych.

Większość zakażeń dróg oddechowych jestwywołana przez wirusy.Tutaj na pierwszym miejscu wirusgrypy, ale też warto zwrócić uwagęna wirus RSV, który przezwiele lat był kojarzony tylko zzapaleniami oskrzelików i zapaleniami płucu dzieci do drugiego roku życia.Teraz coraz częściej te infekcjewykrywamy u osób dorosłych.Z całej tej listy, któratutaj jest pokazana dla Państwa.Chciałabym też zwrócić uwagę nametapneumowirusa.Jest to niezwykle groźny wiruswywołujący zapalenie oskrzelików u niemowląt, udzieci.Może wywołać zapalenia płucu dzieci i u dorosłych.I to, że o nimtak dużo wiemy aktualnie jest związanez nowoczesnymi metodami diagnostycznymi.

Koronawirus to nie tylko wirusSars-Cov-2, ale również te wirusy, którewywołują łagodne zakażenia.Jeżeli chodzi o potwierdzenie wirusowejetiologii zakażeń dróg oddechowych, to niejest możliwe postawienie takiego rozpoznania,postawienie tezy co do wirusa jąwywołującego bez odpowiednich badań.I i, jeżeli chodzi odiagnostykę infekcji wywołanych przez wirusy, totutaj w zasadzie niezależnie odtego, czy to są dolne, czygórne drogi oddechowe, podstawową-- podstawowymmateriałem do badań jest wymaz znosogardła.Tutaj bardzo ważne jest, żebyten wymaz zawierał komórki nabłonka drógoddechowych, jak również śluz, wktórym w obu tych strukturach poszukujemycząsteczek wirusa.W niektórych sytuacjach może byćdo badania pobrany aspirat lub płukanienosowo, płyn z płukania nosowo-gardłowego.U zaintubowanych pacjentów, co oczywiściew POZ-cie nie ma, nie mazastosowania, takim materiałem będzie aspirattchawiczy, popłuczyny, pęcherzykowo-oskrzelikowe czy mini bal.

I jakie są najpowszechniejsze metodywykorzystywane w diagnostyce?Na pierwszym miejscu wpisałam szybkietesty kasetkowe.Niemniej jednak tutaj, jeżeli chodzio szybkie testy kasetkowe, one mająjedną podstawową zaletę, jaką jestwykazanie krążącego wirusa, ale ich wadąjest niska, dosyć niska czułość.I tutaj w zależności odwirusa, który wykrywamy takimi testami, taczułość może rozpoczynać się odsześćdziesięciu procent, co jest niewiele.Dlatego tutaj podstawowym, podstawowym .Podstawową metodą coraz bardziej będą

metody amplifikacji kwasów nukleinowych PCR, realtime PCR, RTPCR w przypadkuwirusów RNA z odwrotną transkryptazą.One-- czy test LAMP, którymożemy zastosować w POCT one dająmożliwość określenia viral load.Niemniej jednak ich wadą jestto, że potwierdzają po prostu obecnośćkwasu nukleinowego wirusa.Nie mówią nam nic ożywych, o żywych, o aktywnych, oaktywnie replikujących się w zasadziecząsteczkach wirusa.Rzadko to będą metody immunofluorescencji,jeszcze rzadziej metoda hodowli.W grupach ryzyka coraz częściejstosujemy panele syndromiczne Multiplex PCR.

Jak interpretować ten wynik metodą--uzyskany metodą PCR?On ma bardzo wysoką czułośćod osiemdziesięciu pięciu do stu procentbardzo wysoką swoistość.Niemniej jednak należy zwrócić uwagęna dwa aspekty pojawienia się wynikówfałszywie dodatnich.Oczywiście pewna grupa wyników fałszywiedodatnich czy fałszywie ujemnych będzie jużeliminowana na poziomie laboratoryjnym, niemniejjednak te, które tu wymieniam naslajdzie powinny być już weryfikowaneprzez lekarza, który ogląda taki wynik.

Przede wszystkim możliwa jest amplifikacjaniespecyficznego, niewirusowego kwasu nukleinowego. I- - możnato łatwo zweryfikować przez odniesieniesię oczywiście do kliniki towarzyszącej uzyskanemuwynikowi.Druga sprawa to wykrywanie tegoszczątkowego, niereplikującego się wirusa.I tutaj bardzo ważnym parametrem,który pozwala nam uniknąć takiej nieprawidłowejidentyfikacji tego wyniku jako wynikdodatni jest CT.

I jak państwo widzą tenslajd, na którym pokazuję techniczny obrazbadania metodą PCR, widzą Państwokrzywe amplifikacyjne.One oznaczają wzrost produktu amplifikacjiw miarę przeprowadzania reakcji.Te wszystkie krzywe, które sąnad czerwoną linią to są wynikidodatnie.I mamy tutaj krzywe, którepojawiają się bardzo szybko i później.One się właśnie pojawiają wtakich punktach zwanych cyklami replikacyjnymi, określanymijako CT.Czym niższe CT, tym wyższestężenie wirusa w próbce.Znaczy się, że czym niższestężenie wirusa w próbce, tym to,że jest on pozostającym tylkokwasem nukleinowym jest wyższe.W jednej z publikacji, którazostała poświęcona temu tematowi, stwierdzono, żetakie pozostawanie w-- u zakażonychpacjentów jest rzeczą, którą możemy przewidzieć.I tak wirus RSV może,może po wyzdrowieniu zalegać jego kwasnukleinowy do czterdziestu siedmiu dni.Adenowirus do czterdziestu czterech dni.A w przypadku wirusa grypyw zasadzie każdy wynik dodatni powinniśmyinterpretować jako prawdziwie dodatni.

W związku z tym, wzwiązku z tym, że ten kwasnukleinowid zalega, będziemy mieć takiesytuacje, kiedy w jednym wyniku badanialaboratoryjnego, robionym jednocześnie dla kilkuwirusów możemy właśnie wykrywać dwa, trzyczy nawet cztery wirusy.Takie wyniki pokażę na końcu.Zapalenie gardła jest również takąjednostką chorobową wywoływaną głównie przez wirusy.Niemniej jednak te zakażenia wirusowew zasadzie diagnozujemy tylko w przypadkuwirusa EBV, w przypadku którego

wykrywamy swoiste przeciwciała.Należy pamiętać z powodów epidemiologicznycho tym, że zapalenie gardła wywołujerównież herpes simplex virus orazwirus HIV.Natomiast taka prawidłowa diagnostyka zapaleniagardła to jest głównie diagnostyka wkierunku bakterii.I tutaj taką bakterią, szczególnieczęsto powodującą zapalenie gardła jest Streptococcuspyogenes.I tutaj mamy w trybiePOCT wykonywany szybki test kasetkowy.Jest on jak najbardziej czułyi swoisty, ale musimy pamiętać, żete wyniki tego testu ujemnezwłaszcza u dzieci, ale coraz więcejpublikacji mówi nam o tym,że również u dorosłych, wyniki ujemnepowinny zostać powtórzone.Nie ma takiej sytuacji, jeżelipowtórzone metodą hodowli albo metodą amplifikacjikwasów nukleinowych.W takiej sytuacji nie maw przypadku zastosowania technik PCR tomoże być jedyne i ostatecznebadanie.Oczywiście tutaj warto te posiewyrobić.Warto robić te hodowle dlatego,że dzięki temu możemy cały czasmonitorować lekowrażliwość tego drobnoustroju.

W związku z zastosowaniem wlaboratoriach coraz częściej techniki spektrometrii masowejnie mamy już metody Lancefield.I tutaj te wyniki, którePaństwo do tej pory dostawali jakopaciorkowce beta-hemolizujące grupa B igrupa G obecnie będą już corazczęściej dla Państwa wysyłane jakoidentyfikacja gatunkowa i tutaj te paciorkowcez tej grupy to będziegłównie Streptococcus dysgalactiae, ale też Streptococcuscanis i Streptococcus equi.Rzadziej występującymi czynnikami zapalenia gardłabędzie Arcanobacterium hemolyticum u nastolatków.Oczywiście pamiętamy o błonicy Corynebacteriumdiphtheriae i w przypadku przewlekłego zapaleniagardła Fusobacterium necrophorum.I tu jest bardzo ważne,dlatego, że laboratorium musi o tymwiedzieć, że jest takie podejrzenie,żeby wykonać hodowlę w warunkach beztlenowych.

Bardzo istotnym aspektem, jeżeli chodzio zapalenia gardła jest to, żejeżeli w hodowli zostanie stwierdzonywzrost Streptococcus pneumoniae czy Neisseria meningitidis,czy Staphylococcus aureus, czy wreszcieHaemophilus influenzae, nie jest to wżadnym wypadku czynnik zapalenia gardła.Jest to po prostu kolonizacjaalbo wynik nosicielstwa.

Strukturami związanymi z drogami oddechowymijest ucho środkowe.I tutaj w zasadzie, jeżelichodzi o diagnostykę mikrobiologiczną, to rozpoznaniejest głównie na podstawie objawówklinicznych i te wskazania wymieniłam poniżej,czyli tutaj głównie brak odpowiedzina antybiotykoterapię i wtedy dopiero tobadanie się wykonuje.I tym badaniem jest ropa,która jest-- wycieka z ucha lubprzez lub przez tympanocyntezę jestpobierana.Zapalenie zatok również nie madiagnostyki jako takiej mikrobiologicznej, dlatego, żetutaj też ta wydzielina jestpobierana przez aspirację czy punkcję.Więc tylko w warunkach szpitalnych.I tutaj absolutnie żadnych wymazówz nosogardzieli czy z jam nosowychnie wykonuje się, żeby ustalićtą etiologię.

Zapalenie oskrzelików i zapalenie oskrzelito głównie domena wirusów, jeżeli chodzio zapalenie oskrzelików.W związku z tym tutajte badania, o których mówiłam wcześniej,czyli amplifikacja kwasów nukleinowych, szybkietesty antygenowe i tutaj główne czynnikiRSV, rhinowirus, jak również dużeznaczenie ma human bocavirus typu pierwszy. Zapalenieoskrzeli to głównie wirus grypy,parainfluenza, wirus RSV, metapneumowirus, koronawirusy.I tutaj dodatkowo dochodzą namczynniki atypowe, czyli Mycoplasma pneumonie, Chlamydophila

pneumonie i Bordetella pertussis.W związku z tym tutajdodatkowo przy atypowych drobnoustrojach oprócz testówNAT stosujemy badania serologiczne.I tutaj ten slajd pominę,ponieważ już Państwo się z nimzapoznali.A i jeżeli chodzi tutaj,przechodząc już do diagnostyki krztuśca wywołanegoprzez Bordetella pertussis, bo jakPaństwo wiedzą doskonale, nie tylko Bordetellapertussis wywołuje takie zakażenia.Krztusiec, ale też zakażenia, pałeczkiBordetella pertussis wywołują łagodną postać krztuścaczy Bordetella bronchiseptica też jestsporadycznie czynnikiem etiologicznym tych zakażeń iBordetella holnessi jest przyczyną sepsy.

I tutaj, jeżeli chodzi odiagnostykę krztuśca niezwykle istotną sytuacją jestdobranie diagnostyki do etapu, dookresu choroby.W pierwszym okresie choroby, kiedypacjent może zgłosić się do lekarzapierwszego kontaktu, będzie to-- tąmetodą będzie PCR i hodowla wfazie kaszlu napadowego, kiedy toobjawy już wyraźnie wskazują na krztusiec.Ten PCR i hodowla niesą już tymi najbardziej czułymi metodami.Wtedy już wchodzimy w metodyserologiczne.Jeżeli chodzi o PCR, którymożemy w tej pierwszej i początkudrugiej fazy krztuśca zastosować, totutaj tak naprawdę ta technika aktualniejest zalecana u niemowląt imałych dzieci i młodzieży, ponieważ te,ci pacjenci najszybciej pojawiają sięz tym uporczywym kaszlem lub wogóle kaszlem u lekarza pierwszegokontaktu.Również PCR możemy wykonywać u

dorosłych, ale kaszel musi trwać poniżejdwóch, maksymalnie trzech tygodni.I tutaj, jeżeli chodzi opobieranie próbek, to bardzo ważne jestto, że pobieramy je nawymazówki dakronowe lub nylonowe i te--to DNA możemy wykrywać mimopodania antybiotyku pacjentowi, dlatego, że wykrywamy,tak jak w przypadku wszystkichtechnik molekularnych, kwas nukleinowy i tenkwas nukleinowy może zalegać dodwudziestu jeden dni od zastosowania antybiotykoterapii.Tutaj mamy troszkę na tymslajdzie takich, takich elementów technicznych.

I tutaj chciałam zwrócić uwagęna to, że nie wszystkie metodyPCR są w jednakowym stopniuwiarygodne, dlatego, że tutaj w przypadkuPCR-u mamy diagnostykę opartą osekwencje insercyjne.Te sekwencje insercyjne, jak Państwowidzą, mogą występować u innych pałeczekBordetella w różnym, w różnychliczbach kopii.Dlatego najbardziej optymalne jest wykorzystaniereakcji, które jednocześnie wykrywają sekwencje insercyjne.To podnosi czułość reakcji, aleteż fragment genu kodującego toksynę krztuścową.

Jeżeli chodzi o serologię, totutaj ta diagnostyka serologiczna jest efektywnau pacjentów, którzy kaszlą powyżejdwóch, trzech tygodni.I tych badań generalnie niezaleca się u dzieci poniżej drugiegoroku życia ze względu naszczepienia z kalendarza szczepień, na ichsłabą odpowiedź w klasie IgA.Jeżeli chodzi o interpretację wynikówserologicznych kierunku krztuśca, to tutaj testypowinny, powinny-- w diagnostyce powinnybyć wykrywane testy, które jako antygenmają toksynę krztuścową i wykrywamytylko w zasadzie i wyłącznie wedługzaleceń przeciwciała klasy IgG.Ale w literaturze i wpraktyce istnieją dwa schematy.Jeden z tych schematów zakładadodatkowo wykrywanie przeciwciał klasy IgA.I kolejna sprawa.Aktualnie wykrywamy przeciwciała w jednostkachmiędzynarodowych na ml.To nam pozwala na interpretację

wyników badania, niezależnie od tych czynnikówdodatkowych: stanu zaszczepienia, wieku pacjenta,czasu trwania choroby i tak dalej.I tutaj za aktualne zakażeniewedług jednego ze schematów uważa siętakie zakażenie, gdzie mamy poziomprzeciwciał klasy IgG powyżej stu jednostekmiędzynarodowych na mililitr.Natomiast jeżeli mamy te przeciwciałaklasy IgG wykrywane w stężeniu czterdzieścido stu jednostek międzynarodowych namililitr, to tu powinniśmy skorzystać zwykrywania przeciwciał klasy IgA iwtedy, jeżeli one są w stężeniupowyżej lub równym dwanaście jednostekmiędzynarodowych na mililitr, mamy do czynieniaz aktualnym zakażeniem.Alternatywną interpretacją jest taka mniejkorzystna, korzystna interpretacja dla klinicysty, amianowicie cut-off dla przeciwciał antytoksynakrztuścowa w zakresie sto, sto dwadzieściapięć potwierdza infekcje w ciąguostatniego roku, natomiast cut-off w zakresiepięćdziesiąt, sześćdziesiąt do stu potwierdzainfekcje w ostatnich kilku lat.

Dlatego w związku z tymiproblemami dobrze jest, dobrze jest skorzystaćz takiego klasycznego sposobu interpretacjiwyników badań serologicznych, a mianowicie zokreślenia dynamiki przeciwciał. Jeżeli pobierzemy odpacjenta próbkę-- kolejną próbkę w odstępiedwóch, czterech tygodni, to stoprocent wzrostu lub pięćdziesiąt procent spadkupoziomu przeciwciał będzie świadczyło otym, że było zakażenie, jest aktualnezakażenie lub że to zakażeniebyło i pacjent jest w-w-w jakbyw fazie leczenia.Jeżeli chodzi o zapalenia płuc,to te zapalenia płuc o etiologiiwirusowej w zasadzie omówiłam natych pierwszych slajdach.Przechodząc do zapalenia płuc oetiologii bakteryjnej mamy tutaj dwie grupy

drobnoustrojów, a mianowicie te klasycznedrobnoustroje ze Streptococcus pneumoniae na czele,który aktualnie jest ciągle napierwszym miejscu, jeżeli chodzi o wywoływaniepozaszpitalnych zapaleń płuc.To tutaj czynnikiem jest hodowla.Tak samo, jak w przypadkuStaphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, czyli tychklasycznych czynników.W przypadku Streptococcus pneumoniae możemypomóc wykrywaniem antygenów moczu, ale dotyczyto tylko i wyłącznie osóbdorosłych.W przypadku drobnoustrojów wywołujących atypowezapalenia płuc, czyli Legionella, Mycoplasma, Chlamydophilapneumoniae czy Chlamydia pneumoniae tonazewnictwo równoległe występuje.Mamy metody przede wszystkim polecaneamplifikacji, ale również w przypadku Legionellamamy wykrywanie antygenów moczu.Ostatnie zalecenia CDC rezygnują wogóle z badań serologicznych w przypadkuMycoplasma pneumoniae.Ta serologia ciągle jest bardzoatrakcyjną alternatywą wykrywania zakażeń tym drobnoustrojem.I Chlamydophila pneumoniae — tutajmamy też wykrywanie-- badania serologiczne, aletu konieczne jest oznaczenie dynamikiprzeciwciał.W przypadku aspiracyjnego zapalenia płucabsolutnie należy wykonać hodowlę w kierunkubeztlenowców.

Patrząc na czas widzę, żemuszę troszkę przyspieszać, więc ograniczę siętylko do tych ważnych elementów.I tutaj to, co --na co chciałam Państwu zwrócić uwagę,jeżeli chodzi o Chlamydophila pneumoniae.Dlaczego to jest tak istotne,żeby wykonywać wy-- badania w dwóchpróbkach?Proszę zobaczyć, jaka jest prewalencja,czyli obecność przeciwciał w populacji.W Polsce około pięćdziesiąt procentosób w badaniach, które wykonywaliśmy paręlat temu, wykazuje swoiste przeciwciałaklasy IgG dla Chlamydophila pneumoniae.W związku z tym nojakby tutaj niezwykle ważne jest stwierdzenie,czy te przeciwciała narastają ina tej podstawie możemy wnioskować ozakażeniu.Jeżeli chodzi o najważniejsze, najważniejszeaspekty diagnostyki w kierunku Mycoplasma pneumoniae,to chciałam zwrócić uwagę na-to,że ciągle ta serologia pozostaje takim--taką najlepszą alternatywą.Oczywiście złotym standardem jest hodowla,której się nie wykonuje.Ale tutaj, jeżeli chodzi o-oprzeciwciała, wykrywamy przeciwciała klasy IgM irównocześnie powinniśmy dążyć do tego,żeby wykrywać i stwierdzać obecność przeciwciałklasy IgG, żeby zapobiegać nieswoistym,nies-nieswoistym krzyżowym reakcjom wykrytym na poziomieprzeciwciał klasy IgM.

Natomiast jeżeli chodzi o PCRbardzo akt-- bardzo ciekawym genem jesttoksyna SARS.Ta toksyna jest bardzo podobna,ma-- wykazuje kilka rejonów homologicznych ztoksyną krztuścową.Dlatego tutaj ten kaszel możewyko-- wywo-- wydawać się bardzo podobnyu tych pacjentów zakażonych jednymi drugim czynnikiem.Możemy również wykrywać w reakcjachPCR fragmenty genów dla in-innych białek,między innymi tutaj swoiste białkoP1.Jeżeli korzystamy z techniki PCR,musimy pamiętać o bardzo wysokim poziomienosicielstwa Mycoplasmy pneumoniae u osóbzdrowych, dlatego warto tutaj wprowadzić punktodcięcia, czyli wartość dziesięć doczwartej kopii na mililitr dla tychwyników uzyskanych metodą PCR lubskojarzyć dwie techniki, a mianowicie wykrywanieprzeciwciał i metoda PCR.Choćby tutaj właśnie potwierdzić tąswoistość przeciwciał klasy IgM.I tak bardzo szybciutko tepanele syndromiczne, o których mówiłam napoczątku.To jest aktualna nasza teraźniejszość

w szpitalach, a pewnie przyszłość wjakiś sposób opisywana już wliteraturze w POZ-ach.A mianowicie mamy możliwość jednoczesne--testowania jednocześnie w kierunku kilkudziesięciu patogenówwywołujących dane, dane objawy chorobowew próbce pobranej w jednej próbcepobranej u pacjenta.I tutaj państwo mają trzytakie panele na górne drogi oddechowe.Proszę zwrócić uwagę mamy tutajzarówno wirusy w panelu, jak atypowebakterie i bakterie klasyczne.Tu mamy taki klasyczny wynik,znaczy klasyczny, jeden z takich wynikwymagający interpretacji.A mianowicie zwróćcie Państwo uwagę,że tutaj dla kilku wirusów uzyskaliśmywynik dodatni.Ta częstość koinfekcji w górnychdrogach oddechowych szacuje się, że wynosido dziesięciu procent.Również tutaj producenci testów, jeżelichodzi o dolne drogi oddechowe opracowalipanel Pneumonia i ten panelwykrywa dwadzieścia siedem patogenów.Również z tych wszystkich grup,o których mówiłam, a jednocześnie genyoporności na antybiotyki.

To zastosowanie jest rekomendowane wpewnych grupach ryzyka ostrej zapale-- ostrymzapaleniu płuc pacjentów krytycznie chorych,nieodpowiadających na terapię empiryczną.Jeżeli chodzi o zastosowanie wPOZ, gdzie głównym materiałem z dolnychdróg oddechowych jest plwocina, tojeszcze tutaj na- jakby producent niezaleca tego rozwiązania, gdyż jakwidzą Państwo na wykresie po prawejstronie ta częstość wykrywania mikrobiotajamy ustnej w plwocinie jest bardzoduża i tak naprawdę wtych patogenach, w tych próbkach, którezostały zbadane kilkoma technikami iz różnych materiałów właściwie tylko Streptococcuspneumoniae wykryty plwociną w panelusyndromicznym na dolne drogi oddechowe siępotwierdził.Ja bardzo dziękuję za uwagę.