Testy w diagnostyce SARS-CoV-2 - co powinniście o nich wiedzieć?

Trwająca od kilku miesięcy pandemia koronawirusa postawiła na nogi przede wszystkim pracowników ochrony zdrowia, a nie do końca poznana natura SARS-CoV-2, zbyt mała liczba przeprowadzanych testów diagnostycznych w kraju oraz deficyt odpowiednich środków ochrony indywidualnej sprawia, że każdy dzień pracy naraża ich na zakażenie.  Podstawowym celem powstrzymania szerzenia się epidemii jest ograniczenie przenoszenia patogenu chorobotwórczego, poprzez identyfikację i izolację osób zakażonych. Lekarze, pielęgniarki oraz ratownicy medyczni, będąc na pierwszej linii frontu walki z koronawirusem codziennie mają styczność z pacjentami potencjalnie zakażonymi, a niekoniecznie prezentującymi objawy COVID-19.  To właśnie w tej grupie zawodowej, przy rosnącej z dnia na dzień liczbie osób zakażonych oraz potencjalnie zakażonych wirusem SARS-CoV-2, kluczowe jest wykonywanie czułych, swoistych i wysokowydajnych testów wykrywających wirusa.

Zakażenie koronawirusem SARS-CoV-2 powoduje chorobę COVID-19, która objawia się gorączką, kaszlem, dusznością i bólem mięśni. Można wyodrębnić trzy postaci choroby: 

• postać łagodną, przebiegającą bez zapalenia płuc lub z łagodnym zapaleniem płuc, 
• postać ciężką, przebiegającą z ciężkim zapaleniem płuc, oraz 
• postać krytyczną z niewydolnością oddechową, wstrząsem septycznym i/lub niewydolnością wielonarządową.

Może także przebiegać bezobjawowo lub z utratą węchu i/lub smaku. Okres wylęgania COVID-19 wynosi najczęściej od 5 do 6 dni, maksymalnie 14 dni. [11] 

W jakich przypadkach przeprowadza się testy w kierunku SARS-CoV-2?

Według zaleceń postępowania w zakażeniach SARS-CoV-2 Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i Lekarzy Chorób Zakaźnych z dnia 24 marca 2020 r. [2], “diagnostyka molekularna z zastosowaniem techniki PCR czasu rzeczywistego (RT PCR) jest podstawą rozpoznania aktywnego zakażenia SARS-CoV-2. Badaniu wykrywającemu materiał genetyczny wirusa powinny zostać poddane osoby spełniające kryteria przypadku podejrzanego o zakażenie koronawirusem.” W przypadku udokumentowanej transmisji lokalnej oznacza to, że każda osoba prezentująca objawy ostrej infekcji oddechowej powinna być traktowana jako osoba potencjalnie zakażona, a tym samym poddana badaniu potwierdzającemu zakażenie. Testy serologiczne natomiast nie powinny być wykorzystywane jako podstawa do diagnozowania, wykluczania zakażenia, czy też do informowania o stanie zakażenia - wynik dodatni może świadczyć zarówno o przebytej, jak i trwającej infekcji,  także innymi szczepami koronawirusa.

Na czym dokładnie polegają testy wykorzystywane w diagnostyce zakażeń SARS-CoV-2?

Test molekularny RT-PCR

Rekomendowaną przez WHO rutynową metodą odpowiednią do identyfikacji i potwierdzenia aktywnego zakażenia SARS-CoV-2 jest metoda Real Time RT-PCR (rRT-PCR), należąca do technik NAAT (z ang. Nucleic Acid Amplification Test - test amplifikacji kwasów nukleinowych). Polega ona na wykrywaniu unikatowych sekwencji RNA wirusa, z potwierdzeniem sekwencjonowaniem kwasów nukleinowych w razie potrzeby. Geny wirusa, na które ukierunkowane jest to badanie, to geny N, E, S i RdRP. [3] 

Materiał do badania RT-PCR powinien pochodzić:

• z górnych dróg oddechowych - najczęściej jest to wymaz z nosogardła lub gardła (zalecane w początkowym stadium infekcji, zwłaszcza w przypadkach bezobjawowych/z łagodnymi objawami) [11]
• z dolnych dróg oddechowych - plwocina (jeśli odkrztuszana), aspirat tchawiczy lub popłuczyny oskrzelowo-pęcherzykowe [3]; (zalecane w późniejszym stadium choroby lub w przypadku ujemnego wyniku badania z górnych dróg oddechowych przy istniejących objawach wskazujących na COVID-19) [11]

Rozważyć także należy pobranie materiału z krwi, stolca, moczu, lub - jeśli od osoby zmarłej - z autopsji. [3] 

Materiał z kału może być wykorzystany w przypadku ujemnych wyników RT-PCR materiału pobranego z górnych/dolnych dróg oddechowych, przy utrzymujących się drugi tydzień objawach wskazujących na COVID-19. [11]

W większości przypadków u pacjentów prezentujących objawy zakażenia SARS-CoV-2, RNA wirusa staje się wykrywalne przy pomocy testu PCR z wymazu z nosogardła już w pierwszym dniu objawów i osiąga szczyt wykrywalności w pierwszym tygodniu od ich pojawienia się. Dodatnie wyniki testów RT-PCR utrzymują się aż przez 3 tygodnie, po czym wirusowe RNA staje się niewykrywalne. [4] Linia czasowa dodatnich wyników testu PCR z materiału uzyskanego z plwociny/popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych oraz z próbki kału różni się jednak od tych pobranych za pomocą wymazu z nosogardła. W ich przypadku wynik może być wciąż pozytywny w momencie, gdy test z wymazu z nosogardła da wynik negatywny. [4] 

Jednakże, jeden lub więcej ujemnych wyników RT-PCR  nie wyklucza infekcji SARS-CoV-2, co spowodowane może być źle pobranym materiałem, złym przechowywaniem, nieobecnością wirusa w miejscu, z którego był pobrany materiał. [11]

Badania serologiczne

Podczas infekcji koronawirusem SARS-CoV-2 indukowana jest typowa odpowiedź immunologiczna. Testy serologiczne, chociaż nie są rekomendowane do diagnostyki aktywnego zakażenia, mogą służyć do rozpoznań retrospektywnych oraz do badań epidemiologicznych. Materiałem do badania w ich przypadku jest krew. Pierwszym wykrywalnym markerem serologicznym jest poziom przeciwciał całkowitych, później IgM i IgG, ze średnim czasem serokonwersji odpowiednio - 15, 18 i 20 dni po ekspozycji na wirusa oraz 9, 10, 12 dni po pojawieniu się pierwszych objawów. [5] Oznacza to, że ujemny wynik badania serologicznego nie wyklucza aktywnego zakażenia koronawirusem, ze względu na tzw. okienko serologiczne. Czułość i swoistość testów serologicznych metodą ELISA, wykorzystywanych do wykrywania przeciwciał IgM i IgG przeciwko wirusowi SARS-CoV-2 zależą od producenta i wahają się w granicach 34-100% dla czułości i 97,7-100% dla swoistości. [1] 

Jak wspomniano wcześniej, najwyższe stężenie przeciwciał po zakażeniu wirusem SARS-CoV-2 pojawia się zwykle 2-3 tygodnie po wystąpieniu objawów. Stężenie przeciwciał IgM zmniejsza się jako pierwsze – praktycznie zanika do 7 tygodnia, a przeciwciała IgG utrzymują się we krwi dłużej. Obecnie nie wiadomo, czy wytworzenie przeciwciał IgG, wywołane przejściem infekcji SARS-CoV-2 zapewnia długotrwałą odporność na ponowne zakażenie.[6] Należy zaznaczyć, że wg. Stanowiska Konsultantów Krajowych “W aktualnej sytuacji epidemicznej nie zaleca się wykonywania testów serologicznych wykrywających przeciwciała anty- SARS-Cov-2 bez indywidualnego zlecenia lekarskiego. Instytucja lub lekarz zlecający wykonanie takiego badania są zobowiązani do interpretacji wyniku, a także zlecenia i sfinansowania wykonania testu RT PCR w celu weryfikacji każdego przypadku dodatniego wyniku testu serologicznego.” Testy wykrywające swoiste przeciwciała mają znaczenie uzupełniające, a potencjalne ich zastosowanie to “Badania populacyjne służące do oceny odsetka osób, które miały kontakt z wirusem,  prowadzenie dochodzeń epidemiologicznych,  badanie ozdrowieńców, w celu uzyskania osocza do celów terapeutycznych.” [9]

Równoczesne stosowanie testów RT-PCR i badań serologicznych może być przydatne w określeniu fazy infekcji wirusem SARS-CoV-2 (patrz: Tabela).

Na podstawie: Rastawicki, W., Rokosz-Chudziak, N., Charakterystyka oraz ocena przydatności serologicznych testów w diagnostyce zakażeń wywołanych przez koronawirusa SARS-CoV-2 na podstawie dostępnych danych producentów. Przegląd Epidemiologiczny 2020;74(1):113-132

Szybkie testy kasetkowe

Wyróżnić można dwa typy szybkich testów diagnostycznych - wykrywające przeciwciała lub antygeny wirusa. Większość z dostępnych testów wykorzystuje technikę immunochromatografii z przepływem bocznym (lateral-flow, LFIA). [1] “Zasada działania tych testów polega na reakcji obecnych w próbce surowicy, osocza, bądź pełnej krwi przeciwciał ze znakowanymi, np. cząsteczkami złota, antygenami wirusa. Powstały kompleks migruje przez membranę nitrocelulozową pod wpływem działania sił kapilarnych i jest ostatecznie wychwytywany przez przyczepione na membranie przeciwciała dla ludzkich immunoglobulin, tworząc czerwoną linię.” [1]

Na podstawie: Rastawicki, W., Rokosz-Chudziak, N., Charakterystyka oraz ocena przydatności serologicznych testów w diagnostyce zakażeń wywołanych przez koronawirusa SARS-CoV-2 na podstawie dostępnych danych producentów. Przegląd Epidemiologiczny 2020;74(1):113-132

Ich zaletą, poza prostotą wykonania, jest krótki czas oczekiwania na wynik - wynosi on ok. 15-40 minut.[7] Test kasetkowy wykrywający antygeny wirusa jest przydatny do identyfikacji ostrej infekcji, ponieważ antygeny można wykryć we krwi w okresie replikacji wirusa. Natomiast pozytywny wynik testu wykrywającego przeciwciała świadczyć może zarówno o aktywnym, jak i przebytym zakażeniu SARS-CoV-2. Niektóre kraje, m.in. w USA, Niemcy, Korea Południowa czy Chiny stosują ten rodzaj testów w mobilnych punktach pobrań „Drive-Thru”, gdzie pobierany jest materiał do badania od pacjentów z podwyższonym ryzykiem zakażenia. [1] Aktualnie WHO zaleca wykorzystywanie testów kasetkowych (o czułości min. 80% i swoistości min. 97%) jedynie w określonych sytuacjach tj. brak możliwości wykonania testu RT-PCR lub zbyt długi czas oczekiwania na wykonanie/wynik testu, podejrzenie ogniska epidemii (w miesjcu z ograniczoną dostępnością testów NAAT) lub w dużych zbiorowiskach czy monitorowanie zachorowalności, zwłaszcza wśród medyków. [10] 

A co z testowaniem pracowników medycznych w kierunku zakażenia SARS-CoV-2?

Nie podlega wątpliwościom, że pracownicy ochrony zdrowia prezentujący objawy zakażenia koronawirusem oraz ci, którzy mieli kontakt z potwierdzonym lub możliwym przypadkiem COVID-19, powinni zostać poddani testom w celu potwierdzenia lub wykluczenia zakażenia oraz ich ewentualnej izolacji. W takim przypadku przeprowadzony powinien zostać test molekularny, cechujący się najwyższą czułością i swoistością, rekomendowany przez WHO. Prawdziwie nurtującą kwestią jest natomiast zasadność wykonywania badań medykom, których stan zdrowia nie wskazuje na infekcję, a których codzienna praca wymaga kontaktu z wieloma osobami. To właśnie występowanie objawów dopiero po kilku dniach od zakażenia, a także możliwość bezobjawowej postaci choroby wywoływanej przez koronawirusa martwi nas najbardziej - lekarz, pielęgniarka, czy ratownik medyczny zakażony SARS-CoV-2, przechodzący infekcję asymptomatycznie, może stanowić zagrożenie dla swoich pacjentów oraz współpracowników. Jednak ze względu na ograniczoną ilość testów nie tylko w Polsce, ale i na świecie, organizacje takie jak WHO i CDC nie zalecają wykonywania testów u osób niemających objawów chorobowych.

Mimo to, wiele krajów przeprowadza obecnie testy serologiczne w poszczególnych grupach zawodowych, w tym pracownikom medycznym. Jak wspomniano wyżej, badania wykrywające przeciwciała mogą dawać wyniki fałszywie ujemne, jeżeli zostaną przeprowadzone w okresie “okienka serologicznego”, a każdy wynik pozytywny musi zostać potwierdzony testem RT-PCR. Nie wiadomo też, czy obecność przeciwciał gwarantuje odporność na ponowne zachorowanie. Wynika z tego, że na chwilę obecną mogą być one przydatne głównie w określeniu zasięgu pandemii oraz czynników ryzyka zakażenia. W Polsce, ze względu na brak konkretnych zaleceń w sprawie testowania pracowników medycznych oraz ograniczoną dostępność testów stworzone zostały inicjatywy, które oferują darmowe badania medykom. Za okazaniem prawa do wykonywania zawodu można poddać się testowi na obecność RNA wirusa (RT-PCR). 

Pandemia koronawirusa zaskoczyła świat i każdego dnia udowadnia niedostateczne przygotowanie wielu organów państwowych na taką sytuację kryzysową. Chociaż grupy ekspertów nieustannie pracują nad zaleceniami dotyczącymi postępowania w obecnej sytuacji, wciąż pozostaje wiele pytań bez odpowiedzi, które z pewnością zaczną się klaryfikować wraz z upływem czasu. 

Referencje:

1. Rastawicki, W., Rokosz-Chudziak, N., Charakterystyka oraz ocena przydatności serologicznych testów w diagnostyce zakażeń wywołanych przez koronawirusa SARS-CoV-2 na podstawie dostępnych danych producentów. Przegląd Epidemiologiczny 2020;74(1):113-132
2. Flisiak R., i wsp., Zalecenia postępowania w zakażeniach SARS-CoV-2 Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i Lekarzy Chorób Zakaźnych, wersja 24-03-2020.
3. WHO. Laboratory testing for coronavirus disease 2019 (COVID-19) in suspected human cases. Interim guidance. 2 March 2020.
4. Sethuraman, N., Jeremiah, S., Ryo, A., Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2. JAMA: May 6, 2020
5. Lou, B., et al., Serology characteristics of SARS-CoV-2 infection since the exposure and post symptoms onset. medRxiv 2020.03.23.20041707
6. https://www.who.int/news-room/commentaries/detail/immunity-passports-in-the-context-of-covid-19 (ostatni dostęp: 17.05.2020)
7. Rapid diagnostic tests for COVID-19. dostępny pod adresem:  www.finddx.org/covid-19 (ostatni dostęp: 17.05.2020)
8. WHO. Advice on the use of point-of-care immunodiagnostic tests for COVID-19. Scientific brief. 8 April 2020